产品目录

本试剂盒基于异丙醇沉淀的原理，适用于高通量质粒的快速制备，可在2～3小时内完成96样本的质粒DNA提取。本试剂盒采用特制的96孔过滤板和溶液III能够快速高效的提取到高纯度的质粒DNA。纯化得到的质粒DNA适用于大规模测序，同时可用于一些常规分子生物学操作，如酶切、文库筛选、连接和转化等应用。

• 方便简捷：可在2～3小时内完成96个样品的提取。
  
• 配备了独特的IndRed试剂，可以清晰辨明质粒裂解过程中裂解程度。
  
• 纯度高：可直接用于下游实验。

• 若溶液产生沉淀，使用前可在37℃水浴中预热10min以溶解沉淀，不影响效果。
  
• 溶液P1加入RNase A后，应置于2～8℃保存，可稳定保存6个月。
  
• 单独包装的RNase A可在室温保存12个月。

• 96孔板细菌培养方法：96深孔板中每孔添加1.0～1.3mL含相应抗生素的培养基，挑取单克隆摇菌，加盖透气膜封板以防污染，在220～280rpm 37℃条件下培养。
  
• 溶液P1使用前请先加入RNaseA （请分批配制，每125mL P1加入1.25mL RNase A浓度10mg/mL，可用于4板提取反应），混匀，置于2～8℃保存。
  
• 使用前先检查溶液P2和溶液III是否出现浑浊，如有混浊现象，可置于37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。溶液P2和溶液III使用后应立即盖紧盖子。
  
• 所有离心步骤均为室温下进行离心。
  
• 提取质粒得率与细菌的培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

• 向96孔深孔板中添加1.0～1.3mL摇好的菌液（或者取摇好菌液的96孔板），加盖封口膜，3600rpm(～2130×g)离心10min收集菌体，倒掉培养基，倒扣于吸水纸上除去残留的培养基。
  
  • 如果菌体浓度较低，可以重复集菌一次。
• 向96孔深孔板中每孔加入250μL溶液P1 (请先检查是否已加入RNase A)，加盖封口膜，使用旋涡混合器彻底悬浮菌体。
  
  • 若溶液P1添加了IndRed试剂，则此时为红色。
• 揭去封口膜，向96孔深孔板中每孔加入250μL溶液P2，加盖新的封口膜，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，瞬时离心使封口膜上的液体回落板中。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，若使用IndRed试剂，完全混匀时颜色为紫色，若裂解不充分会有部分红色残留。混匀后菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。
• 揭去封口膜，向96孔深孔板中每孔加入250μL 4℃冷却的溶液III，加盖新的封口膜，立即温和地上下翻转10次左右，充分混匀后室温放置5min，瞬时离心使封口膜上的液体回落板中。
  
  • 溶液III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。若使用IndRed试剂，完全混匀后颜色会从紫色变为黄色。
• (可选步骤)将此96孔深孔板置于沸水浴中煮沸5min。
  
  • 宿主菌是endA+(TG1、JM系列及其衍生物、HB101)时建议采用此处理步骤，防止有核酸酶的污染导致质粒难于长期保存，若宿主菌是endA- (DH5α、TOP10)，此步骤可省略掉。煮沸时间不宜超过5min，否则易出现基因组污染。
• (可选步骤)将此96孔深孔板转入冰水浴中15min左右，充分冷却至室温。
  
  • 若采用步骤5，此步骤必须.若不采用步骤5，此步骤可省略掉。加热后的96孔深孔板必须采用该步骤充分冷却至低温，否则影响异丙醇沉淀步骤。
• 揭去封口膜，将步骤4或步骤6中的裂解液吸入96孔过滤板中（过滤板叠放在一新的无菌96孔深孔板上），3600rpm(～2130×g)离心5min。
  
  • 离心之后用吸水纸完全吸干96孔深孔板板面上的水珠。若吸水纸未完全吸干板面，则有可能导致下步骤添加异丙醇后因密闭不好使封口膜与96孔板分离。
• 向过滤后的清液中每孔加入500μL室温的异丙醇，加盖新的封口膜，上下颠倒5～6次充分混匀，室温3600rpm(～2130×g)离心20min，小心倒掉上清，倒扣于吸水纸上。
  
  • 为防止交叉污染，新加盖的封口膜必须完全紧密的贴在96孔深孔板上；倒掉上清后质粒DNA为无色透明，不易看到。
• 向每孔中加入600μL 4℃预冷的70%乙醇，加盖新的封口膜，上下颠倒3～4次充分漂洗质粒DNA，3600rpm(～2130×g)离心5min，小心倒掉上清，倒扣于吸水纸上，风干15～20min或真空干燥10min。
  
  • 干燥不完全时乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
• 使用排枪向96孔深孔板中加50～100μL溶解液TB，加盖新的封口膜，涡旋1～2min帮助质粒DNA溶解。
  
  • 最适的溶解体积取决于质粒的拷贝数和用于下游实验所要的DNA浓度。
    
  • 溶解液的pH值对于质粒长期保存有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低质粒DNA的稳定性；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

• 以下步骤同离心法中的第1～6步骤操作方法。
  
• 接离心法第6步骤之后，揭去封口膜.将一新的无菌96孔深孔板放入负压装置内，将96孔过滤板放在负压装备的支架上。96孔过滤板每一个孔应插入96孔深孔板的每一个孔中。将深孔板中的裂解液吸到96孔过滤板中，调节负压抽干溶液。
  
  • 抽干之后用吸水纸完全吸干96孔深孔板板面上的水珠。若吸水纸未完全吸干板面，则有可能导致下步骤添加异丙醇后因密闭不好使封口膜与96孔板分离。
• 向过滤后的清液中加入500μL室温的异丙醇，加盖新的封口膜，上下颠倒5～6次充分混匀，室温3600rpm(～2130×g)离心20min，小心倒掉上清，倒扣于吸水纸上吸干板面水珠。
  
  • 为防止交叉污染，新加盖的封口膜必须完全紧密的贴在96孔深孔板上；倒掉上清后质粒DNA为无色透明，不易看到。
• 向每孔中加入600μL 4℃预冷的70%乙醇，加盖新的封口膜，上下颠倒3～4次充分漂洗质粒DNA，3600rpm(～2130×g)离心5min，小心倒掉上清，倒扣于吸水纸上，风干15～20min或真空干燥10min。
  
  • 干燥不完全时乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
• 使用排枪向96孔深孔板中加50～100μL溶解液TB，加盖新的封口膜，涡旋1～2min帮助质粒DNA溶解。
  
  • 最适的溶解体积取决于质粒的拷贝数和用于下游实验所要的DNA浓度。
    
  • 溶解液的pH值对于质粒长期保存有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低质粒DNA的稳定性；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

• IndRed是一种颜色指示剂，用以指示整个操作的正确性，不影响任何下游实验且对人体无害。IndRed为可选试剂，客户根据需求选择是否添加。
  
• 在使用之前按IndRed∶P1＝1∶200进行添加，颠倒混匀至完全均匀。
  
• 在使用时添加IndRed的P1溶液为红色。
  
• 添加P2之后红色完全变为紫色说明充分裂解。
  
• 再添加溶液III溶液之后匀相状态为黄色说明中和复性充分。